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Aktivität 25.3 Welche Effekte können ausgewählt werden?

Ribosomeninaktivierende Proteine ​​RIP sind eine Familie von Pflanzenenzymen, für die eine einzigartige Aktivität bestimmt wurde: Kürzlich haben wir gezeigt, dass der RIP aus Saponaria officinalis eine viel breitere Substratspezifität aufweist: Hier erweitern wir Studien zur Substratspezifität auf die bekanntesten RIP: Aus experimentellen Beweise Die gesamte Klasse von Pflanzenproteinen, die bisher als Ribosomen-inaktivierende Proteine ​​bezeichnet wurden, kann als Polynukleotid klassifiziert werden: Die neu identifizierten Substrate können an der biologischen Rolle von RIP beteiligt sein.

Die Klasse der Pflanzenproteine, die als Ribosomen-inaktivierendes Protein RIP bezeichnet werden, sind Enzyme, die eine irreversible Schädigung der Ribosomen katalysieren, die die glykosidische Bindung eines einzigartigen, hochkonservierten Adenosinrests an der Haupt-rRNA hydrolysieren: A 4324 im Fall von Rattenleber-rRNA, siehe Lit.

Bis vor kurzem war dies das einzige bekannte Substrat für RIP. Diese Homogenität bei der Substraterkennung durch die verschiedenen RIP wurde durch mehrere Beobachtungen in Frage gestellt: Die Substratspezifität von Saporin-L1 wurde im Detail untersucht, zusammen mit den optimalen Bedingungen für die enzymatische Aktivität 7. Wir beschlossen, die Studie zur Substratspezifität auf zu erweitern so viele RIP wie verfügbar, unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die für Saporin-L1 bestimmten optimalen Bedingungen für die enzymatische Aktivität ganz anders zu sein scheinen als die bisher für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität von RIP auf Ribosomen verwendeten.

Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass alle getesteten RIP auf DNA und viele auf verschiedene polynukleotide Substrate einwirken und Adenin aus dem Zuckerphosphatgerüst von Poly- und Polydeoxy-Nukleotiden freisetzen.

Die früher als RIP bezeichneten Pflanzenproteine ​​können daher als Polynukleotid klassifiziert werden: Polynukleotidquellen: Ricin, Ricinus-Agglutinin RCA120, Volkensin und Saporine wurden wie in 3, 8 bzw. 9 beschrieben gereinigt. Rekombinantes Saporin-S6 [Saporin-S6r: Soria, Mailand, Italien, von Dr. H. Yeung, Hongkong, und von Professor J. Lord, Coventry, UK. Anderes Polynukleotid: Benvenuto, Rom, Italien, wurde durch Phenolextraktion und Ethanolfällung aus gereinigten Virusisolaten hergestellt.

Als Standard verwendetes Adenin stammte von Sigma. Alle anderen Reagenzien waren analysenrein oder molekularbiologisch und nach Möglichkeit RNase-frei. Wasser war Milli-Q Waters-Millipore. Chloracetaldehyd wurde gemäß 13 hergestellt. Die Bestimmung des freigesetzten Adenins und andere experimentelle Details sind in Materialien und Methoden angegeben. Die Reaktionsbedingungen, die zuvor als optimal für Saporin-L1 7 bestimmt wurden, sind in den Legenden zu den entsprechenden Tabellen und Abbildung 1 angegeben.

Die gewählten Reaktionsbedingungen waren diejenigen, die für die Bestimmung der RIP-Aktivität auf Rattenleber-Ribosomen [Hemmung der Poly-U-gerichteten Phenylalanin-Polymerisation] optimal waren, wie in früheren Versuchsergebnissen bestimmt, die nicht gezeigt wurden. Diese Screening-Experimente wurden mit einer hohen Konzentration an RIP durchgeführt, um die Aktivität unter Bedingungen nachzuweisen, die nicht optimal sein könnten, und um den möglichen Mangel an Cofaktoren 14 zu überwinden.

Diese Enzymkonzentrationen sind ohnehin niedriger als diejenigen, die natürlicherweise in subzellulären Kompartimenten vorkommen, in denen RIP lokalisiert ist [e. Phytolacca americana- und Saponaria officinalis-Gewebe 15, 16] und niedriger als diejenigen, die erforderlich sind, um die Aktivität von Ricin und anderem RIP auf nackten ribosomalen RNAs zu zeigen [für eine Übersicht siehe 1]. Alle anderen RIP zeigten unter den gegenwärtigen Versuchsbedingungen eine geringe oder keine nachweisbare Aktivität auf diesem Substrat.

Es wurde eine Variabilität in der Aktivität verschiedener Chargen von natürlichem Saporin-S6 gefunden, was möglicherweise auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass Zubereitungen von natürlichem Saporin-S6 eine variable Mischung verschiedener Isoformen 17 sind. Daher haben wir drei verschiedene rekombinante Saporin-S6-Genprodukte getestet , die alle auf viralen RNAs inaktiv waren. Die Reaktionsbedingungen waren diejenigen, die als optimal für Saporin-L1 7 bestimmt wurden.

Überraschenderweise waren Ricin und verwandtes zweikettiges RIP, das reduziert werden muss, um auf Ribosomen 18 zu wirken, bereits vor der Reduktion auf DNA aktiv.

Die Denaturierung der DNA vor dem Assay erhöhte die Depurinierungsraten nicht signifikant, außer im Fall der nicht gezeigten Momordin I-Ergebnisse. Aktivität auf gereinigtem E. Aus der linearen Regressionsanalyse wurde eine Freisetzung von 856 aus hsDNA und 657 [aus Poly A] mol Adenin pro mol Enzym berechnet.

Die Möglichkeit einer Kontamination von RIP-Präparaten durch andere Enzyme scheint durch die sorgfältigsten Reinigungsverfahren 3, durch die geringe Menge an Enzym, die für die Aktivität erforderlich ist, ausgeschlossen zu sein. Abb. Nach unserem Kenntnisstand gibt es keine Enzyme mit der in dieser Arbeit beschriebenen Aktivität. Innerhalb der Grenze der geringen Anzahl von Beobachtungen besteht eine Konsistenz zwischen den Ergebnissen, die unter Verwendung von Bakteriophagen-RNA aus MS 2 und pflanzlichen viralen RNAs, möglichen natürlichen Substraten, erhalten wurden.

Die unterschiedliche sterische Hinderung von Ribosomen und hsDNA kann für diesen Unterschied verantwortlich sein. Der jüngste Bericht, dass eine mutierte nicht reduzierbare Form von Ricin immer noch zytotoxisch ist 20, legt nahe, dass die Depurinierung nicht ribosomaler Substrate zur Toxizität von Ricin und verwandten Toxinen beitragen kann.

Die Depurinierung von Poly A, RNA und DNA erfolgt in Abwesenheit eines Cofaktors, obwohl ein Einfluss von Cofaktoren, wie sie von Carnicelli et al. DNA, RNA und Poly A werden alle durch einen RIP mehrfach deadenyliert, was darauf hinweist, dass eine spezifische Nukleotidsequenz im Substrat nicht erforderlich ist, damit diese Enzyme wirken.

Mehrere molekulare Strukturen von RIP wurden im Detail aufgeklärt und nur eine mögliche enzymatische Stelle wurde identifiziert, was darauf hinweist, dass die Aktivität auf Ribosomen und auf anderen Substraten auf dieselbe aktive Stelle zurückzuführen ist. Relevant für die vorliegende Arbeit sind die Beobachtungen, dass mit Ricin vergiftete Mäuse Einzelstrangbrüche in DNA 21 zeigten und einige RIP- und Ricin 22-26-Typ-1-Kerben Kerben in supergewickelte doppelsträngige DNA einführten.

Interessanterweise wirkten sowohl Ricin als auch Kampfer, ein anderer Typ-2-RIP, nicht reduziert 23, was mit dem übereinstimmt, was in der vorliegenden Arbeit mit hsDNA-Tabelle 2 beobachtet wurde. Es ist möglich, dass dieser RIP tatsächlich Adenin aus der DNA entfernte, das zerbrechlicher wurde und dann spontan oder darunter brach die Wirkung kontaminierender Nukleasen. DNA und Ribosomen, die von allen RIP konsistent depuriniert werden, sind möglicherweise die besten Kandidaten für das natürliche Substrat dieser Enzyme.

Die Wirkung auf nicht-ribosomale RNA und Poly A kann entweder zufällig sein oder eine möglicherweise zusätzliche biologische Rolle ausdrücken. Somit kann die Unterteilung von RIP basierend auf der Substratspezifität mit ihrer natürlichen Aktivität korreliert werden.

RIP mit hoher Aktivität auf DNA stammen von Pflanzenarten, die zur Ordnung der Caryophyllales gehören, während RIP von Cucurbitaceae eine geringere Aktivität aufweisen, was darauf hindeutet, dass es einen evolutionären Unterschied entweder in der Substratfeinspezifität oder in den Anforderungen an das Maximum geben kann Aktivität.

Darüber hinaus scheint es, dass die verschiedenen Formen von RIP, die von derselben Pflanze 1 produziert werden, häufig funktionell unterschiedlich sind, wobei alle auf Ribosomen von Säugetieren aktiv sind, aber eine sehr unterschiedliche Aktivität auf Nukleinsäuren aufweisen.

Dies legt nahe, dass RIP mit unterschiedlicher Substratspezifität, die von einer einzelnen Pflanzenart produziert wird, eine andere funktionelle Rolle spielen kann. Keine Korrelation zwischen dem Samen, dem Blatt usw. des Gewebeursprungs.

Die vorliegenden Ergebnisse können helfen, die Funktion von RIP in der Natur zu verstehen. Für RIP wurden mehrere Rollen vorgeschlagen, jede mit einem zugehörigen Substrat für die enzymatische Wirkung [Übersicht in 1]. Einige dieser Rollen können auf der Grundlage der neu identifizierten Substratspezifitäten von RIP neu angesprochen werden, wenn letztere auch in vivo gelten: In dem weithin akzeptierten Mechanismus der antiviralen Wirkung sind die autologen Ribosomen das Ziel von RIP: Obwohl eine direkte Wirkung auf das gesamte Virus seit den ersten Experimenten ausgeschlossen wurde, legen die vorliegenden Ergebnisse nahe, dass der RIP, der verschiedene Formen von RNA deadenyliert, direkt auf virale RNA wirken könnte.

Die Lokalisierung von PAP in hohen Konzentrationen zwischen Zellwand und Plasmamembran in Kermesbeerenblättern 15 sollte den Kontakt von RIP-viralen Nukleinsäuren ermöglichen. Da zu einem bestimmten Zeitpunkt aller Virusinfektionen eine DNA-Matrize vorhanden ist, kann die Depurinierung von aus Viren stammender DNA auch Schutz gegen alle Viren bieten. Die vorliegende Arbeit weist darauf hin, dass retrovirale DNA wie für HIV 24 vorgeschlagen beschädigt werden könnte, und obwohl dies definitiv nicht physiologisch ist, deutet die Anti-HIV-Aktivität von RIP auf Mechanismen hin, die auch in Pflanzensystemen funktionieren können.

Die RIP-Aktivität tritt auf oder steigt an, wenn die Samen 3 reifen und in seneszenten oder gestressten Blättern 6, 29, 30, in Korrelation mit Ereignissen, die zum Stillstand des Stoffwechsels von Pflanzenzellen führen. Die Aktivität auf DNA kann durchaus zu dieser Regulation beitragen, da die Entfernung weniger oder sogar eines Adeninrests ausreichen kann, um die Transkription zu stören. Die Depurinierung autologer DNA kann eine Ursache für den programmierten Zelltod bei der Seneszenz von Blättern sein. DNA-Schäden können auch eine Rolle bei der Pathogenese der durch RIP induzierten Läsionen spielen, und insbesondere bei der für Apoptose typischen DNA-Fragmentierung, die in kultivierten Zellen beobachtet wird, die RIP von Typ 31-37 ausgesetzt sind, und in Geweben von Ratten, die mit Ricin und Abrin vergiftet sind 38.

Es sei jedoch daran erinnert, dass die Hemmung der Proteinsynthese per se ausreicht, um Apoptose sowohl in der Rattenleber 39 als auch in den kultivierten Zellen 31, 32, 40 zu induzieren, und somit die durch RIP induzierte Apoptose durch die mitgebrachte ribosomale Inaktivierung erklärt werden könnte etwa durch diese Proteine.

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